|
Фотоактивируемые флуоресцентные белки
|
Фотоактивируемые флуоресцентные белки обладают уникальной способностью менять спектральные характеристики под воздействием интенсивного света определенной длины волны. Это делает их удобным инструментом для мечения клеток, клеточных органелл и белков с целью последующего мониторинга их перемещений внутри живого организма.
После экспрессии белка, отдельные клетки, клеточные органеллы, содержащие флуоресцентный белок, или пул молекул химерного белка, включающего фотоактивируемый репортер и белок-мишень, облучают интенсивным светом определенной длины волны. В облучаемых объектах происходит фотоконверсия фотоактивируемого белка-репортера и изменяются его спектральные характеристики. После этого становиться возможным наблюдать за перемещениями "перекрашенных" объектов в режиме реального времени (Chudakov et al., 2004; Gurskaya et al., 2006; Chudakov et al., 2007).
|
Фотоактивируемые флуоресцентные белки могут быть также использованы для определения скорости деградации белков-мишеней в клетке. После экспрессии химерного белка, включающего фотоактивируемый репортер и белок-мишень, весь такой белок подвергается фотоконверсии. Полученный пул "перекрашенных" молекул отличается по спектральным характеристикам от новосинтезируемых молекул и изменение интенсивности его флуоресценции отражает процесс деградации белка (Zhang et al., 2007).
Таблица основных свойств фотоактивируемых флуоресцентных белков
БЕЛОК
|
PS-CFP2 |
PA-TagRFP |
KFP-Red |
до фото-
конверсии | после фото-
конверсии |
до фото-
конверсии | после фото-
конверсии |
до фото-
конверсии | после фото-
конверсии |
| Яркость, произведение коэффициента молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции, деленное на 1000;
К экст., коэффициент молярной экстинкции.
|
| Цвет флуоресценции | голубой | зеленый |
нет |
красный |
нет |
красный |
| Максимум возбуждения (нм) |
400 |
490 |
- |
562 |
580 |
580 |
| Максимум эмиссии (нм) |
468 |
511 |
- |
595 |
600 |
600 |
| Квантовый выход |
0,20 |
0,23 |
- |
0,38 |
<0,001 |
0,07 |
| К экст. (M-1cm-1) |
43000 |
47000 |
- |
66000 |
123000 |
59000 |
| Яркость |
8,6 |
10,8 |
- |
25,1 |
- |
4,1 |
| Яркость, % от EGFP |
26 |
33 |
- |
75 |
- |
12 |
| Контраст |
2000 раз |
540 раз |
35-70 раз |
| Свет активации |
УФ (405 нм) |
УФ (390-420 нм) |
зеленый (530-560 нм) |
| pKa |
4,3 |
6,1 |
- |
5,3 |
нет данных |
нет данных |
| Структура |
мономер |
мономер |
тетрамер |
| Агрегация |
нет |
нет |
нет |
| Токсичность для клеток |
не детектируется |
не детектируется |
не детектируется |
| Скорость созревания при 37°C |
быстрая |
быстрая |
средняя |
| Молекулярный вес (кДа) |
26 |
27 |
26 |
Список статей:
- Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat Protoc. 2007; 2 (8):2024-32. / pmid: 17703215
- Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol. 2004; 22 (11):1435-9. / pmid: 15502815
- Souslova EA, Chudakov DM. Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor. Microsc Res Tech. 2006; 69 (3):207-9. / pmid: 16538627
- Zhang L, Gurskaya NG, Merzlyak EM, Staroverov DB, Mudrik NN, Samarkina ON, Vinokurov LM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. Biotechniques. 2007; 42 (4):446, 448, 450. / pmid: 17489230
- Gurskaya NG, Verkhusha VV, Shcheglov AS, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Lukyanov S, Lukyanov KA. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 2006; 24 (4):461-5. / pmid: 16550175
|
