|
Нормализация кДНК
- Цитирование
|
Нормализация кДНК -- выравнивание концентрации различных типов молекул в образцах кДНК -- позволяет существенно снизить уровень высокопредставленных транскриптов в популяции кДНК и, таким образом, облегчает дальнейшее исследование транскриптома (широкомасштабное секвенирование, функциональный скрининг). В случае тотальной РНК прокариот нормализация позволяет значительно снизить уровень рибосомальной кДНК.
Евроген предлагает многоуровневый сервис, позволяющий получать нормализованные образцы кДНК, оптимизированные для различных технологий секвенирования, и библиотеки кДНК, обогащенные полноразмерными последовательностями, на основе тотальной или поли(А)+ РНК эукариот и тотальной РНК прокариот.
Синтез первой цепи и амплификация кДНК осуществляют с использованием технологии Mint или с рассеянной затравки (random primers). Для нормализации кДНК используют метод на основе дуплекс-специфической нуклеазы.
Клонирование нормализованных образцов кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями, осуществляют направленно по сайтам рестрикции SfiIA - SfiIB, SrfI - NotI или AscI - NotI в стандартный плазмидный вектор. Для контроля качества клонирования определяют процент рекомбинантов и средний размер вставки для 22 случайно отобранных клонов.
Для амплификации первичные библиотеки рассевают в 5 плашках (25x25 см, примерно 105 колоний на плашку); клоны смывают LB-средой с ампицилином; к амплифицированным библиотекам добавляют глицерин до конечной концентрации 17%. Хранение полученных библиотек кДНК осуществляют при –70°C.
|
Материалы, предоставляемые Заказчиком:
-
3-5 мкг тотальной РНК эукариот
-
1-2 мкг поли(А)+ РНК эукариот
-
3-5 мкг тотальной РНК прокариот
-
Биологический материал (ткань, культура клеток) для выделения РНК
Описание работ:
| КАТ.# | ОПИСАНИЕ | СТАРТОВЫЙ МАТЕРИАЛ | ЦЕНА, РУБ. | СРОК ВЫПОЛНЕНИЯ | |
Цены действительны на территории Российской Федерации и не включают доставку. |
| Приготовление нормализованной кДНК
|
|---|
CS010-1
Новый сервис!
|
Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями
и фланкированной на 3'-конце Т-праймером, содержащем поли(Т) последовательность, разбитую несколькими С и G нуклеотидами. Использование такого праймера позволяет избежать проблем при секвенировании гомополимерных участков на 454 секвенаторе. Последовательности 5'- и 3'-адаптеров так же содержат ассиметричные сайты рестрикции SfiI. кДНК может быть использована для секвенирования на секвенаторах 454, Illumina и ABI SOLiD,
направленного клонирования или других приложений.
|
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
55000 |
2-4 недели |
| CS010-1A |
Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной одинаковыми адаптерами.
Для синтеза кДНК используется Т-праймер, содержащий поли(Т) последовательность, разбитую несколькими С и G нуклеотидами. Использование такого праймера позволяет избежать проблем при секвенировании гомополимерных участков на 454 секвенаторе.
|
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
50000 |
2-4 недели |
| CS010-1B |
Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной адаптерами, содержащими ассиметричные сайты рестрикции SfiI. кДНК может быть использована для направленного клонирования или секвенирования на секвенаторах Illumina и ABI SOLiD. |
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
50000 |
2-4 недели |
| CS010-1C |
Для синтеза кДНК используется Т-праймер, содержащий рестриктный сайт GsuI, позволяющий удалить поли(А)-последовательности кДНК перед секвенированием на 454 секвенаторе. |
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
50000 |
2-4 недели |
| CS010-1D |
Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной 5'-концевыми последовательностями, со случайной затравки. |
Поли(А)+ РНК эукариот |
50000 |
2-4 недели |
| CS010-1E |
Приготовление нормализованной кДНК прокариот со случайной затравки. Нормализация значительно снижает уровень рибосомальной ДНК в образцах. |
Тотальная РНК прокариот |
50000 |
2-4 недели |
| Конструирование нормализованных библиотек кДНК
|
| CS011-2A |
Приготовление образцов нормализованной кДНК для направленного клонирования; лигирование образцов в плазмидный вектор.
|
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
70000 |
3-5 недель |
| CS011-2B |
Приготовление неамплифицированных нормализованных библиотек кДНК, содержащих приблизительно 100000 независимых клонов. |
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
85000 |
4-6 недель |
| CS011-2C |
Приготовление амплифицированных нормализованных библиотек кДНК, содержащих приблизительно 400000 независимых клонов. |
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
85000 |
4-6 недель |
| CS011-3A |
Приготовление неамплифицированных нормализованных библиотек кДНК + анализ эффективности нормализации путем секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки. |
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
125000 |
5-7 недель |
| CS011-3B |
Приготовление амплифицированных нормализованных библиотек кДНК + анализ эффективности нормализации с помощью секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки. |
Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот |
125000 |
5-7 недель |
| Дополнительные услуги |
|---|
| Выделение тотальной РНК из тканей |
+10000 |
+1 неделя |
| Наработка кДНК в препаративных количествах (до 30 мкг) |
950 за 1 мкг |
+ 1 день |
| Клонирование библиотек в нестандартный вектор |
договорная |
договорной |
| Анализ эффективности нормализации с помощью псевдо-Нозерн блота, ПЦР или ПЦР в реальном времени |
договорная |
+1-3 недели |
Результат работы (передается Заказчику):
1. Амплифицированная ненормализованная кДНК (1 мкг)
2. Праймеры для амплификации кДНК
3. Амплифицированная нормализованная кДНК (2 мкг)
4. Нормализованная кДНК, лигированная в бактериальный вектор (для уровня CS011-2A)
5. Охарактеризованная нормализованная библиотека кДНК, согласно выбранному уровню сервиса
6. Очищенная плазмидная ДНК 90 клонов с результатами их секвенирования (для уровней CS011-3A, CS011-3B)
7. Отчет о проделанной работе
 |  |
Результат нормализации кДНК из тканей человека. (А) результат гель-электрофореза исходных (1) и нормализованных (2) образцов кДНК. (Б) Псевдо-Нозерн блот гибридизация этих образцов с [P32]-мечеными фрагментами генов глицеролфосфатдегидрогеназы (GPDH) и убикуитина С (UBC).
M - 1-kb маркер длин ДНК (СибЭнзим); эм. - эмбриональный; тонк. киш. - тонкая кишка. |
|---|
Вниманию заказчика
В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.
Конфиденциальность
Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе выполнения и обсуждения заказа.
|
