Удаление избытка копий рибосомальной РНК из образцов кДНК
(деплеция рибосомальной кДНК)

Синтез кДНК с рассеяной затравки широко применяется в ситуациях, когда использование олиго(dT)-праймера невозможно или нецелесообразно, например, при работе с неполиаденилированной РНК микроорганизмов или с частично деградированной тотальной РНК эукариот (например, РНК, выделенной из парафиновых блоков; РНК из крови, хранящейся на фильтрах и тд). В этих случаях высокая концентрация рибосомальных и транспортных РНК (до 95%) существенно осложняет секвенирование образцов кДНК, а также анализ профиля экспрессии генов на чипах. Деплеция кДНК-копий, соответствующих рибосомальной и транспортной РНК, с помощью дуплекс-специфической нуклеазы приводит к уменьшению их количества в образце тотальной кДНК при сохранении относительной представленности других транскриптов*. Использование таких образцов значительно повышает эффективность исследования транскриптома (например, сравнительного анализа профилей экспрессии генов из патогеннных и непатогенных микроорганизмов или генов из опухолевых и здоровых тканей).

Синтез и амплификация кДНК осуществляют с рассеяной затравки на основе тотальной РНК про- или эукариот. Избыток кДНК-фрагментов, соотвествующих рибосомальной и транспортной РНК, удаляют с помощью дуплекс-специфической нуклеазы. Эффективность деплеции контролируют с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени. Использование праймеров, содержащих специально-подобранные концевые адаптерные последовательности, позволяет получать кДНК готовую для секвенирования на высокопроизводительных машинах нового поколения или для приготовления проб для гибридизации.

Материалы, предоставляемые Заказчиком:

• 3-5 мкг тотальной РНК
• Биологический материал для выделения РНК
• Информация о структуре транскриптов для анализа эффективности процедуры

Описание работ:

Результат работы (передается Заказчику):

1. Амплифицированная недеплецированная кДНК (1 мкг)

2. Амплифицированная деплецированная кДНК (2 мкг)

3. Праймеры для амплификации кДНК

5. Отчет о проделанной работе

		Уровень представленности различных транскриптов и рРНК в образцах кДНК до и после деплеции. Белые столбцы – относительная концентрация (у.е.) фрагментов кДНК в образцах до деплеции; оранжевые столбцы – после деплеции. (А) образцы кДНК человека: 18S – 18S рРНК, 28S – 28S рРНК, ACTB – β-актин, GAPDH – глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, TBP – белок, связывающий TATA-box; IGFR – иммуноглобулин G Fc рецептор II; IFN-γR – интерферон-гамма рецептор. (Б) образцы кДНК E. coli: 16S – 16S рРНК, 23S – 23S рРНК, Adk – аденилат циклаза, NarP – белок регуляции нитрат-нитритного дыхания, TalB – трансальдолаза B.