Техническая информация

WTB-PCR

Технология обнаружения редких аллелей с помощью мутационно-специфической ПЦР

Мутационно-специфическая ПЦР(мс-ПЦР) или Wild-Type Blocking PCR (WTB-PCR) - одна из наиболее эффективных технологий обнаружения редких аллелей, содержащих точечные мутации (единичные однонуклеотидные замены или небольшие делеции/инсерции).

Сутью технологии является введение в ПЦР-смесь дополнительных модифицированных олигонуклеотидов-блокаторов, комплементарных последовательности исследуемого региона ДНК "дикого типа", с достаточно высокой температурой плавления (Seyama et al., 1992; Orou et al., 1995; Dominguez et al., 2005). В ходе ПЦР эти олигонуклеотиды не отделяются от своей мишени на этапах отжига и элонгации, и таким образом препятствуют синтезу новых копий ДНК.

При наличии в исследуемом регионе хотя бы одной точечной мутации температура плавления блокаторов значительно снижается, и ПЦР проходит беспрепятственно.

Механизм действия Wild-Type Blocking PCR (WTB-PCR)

Стандартный анализ vs Инсайдер

Tot - Общая реакция;
Mut - Мутационно-специфическая реакция

Анализ мутаций в 15-м экзоне гена BRAF методом ИНСАЙДЕР: уточнение характера мутации и выявление микрометастазов в лимфатическом узле.

А, Б, В – первичная опухоль: меланома кожи; Г, Д, Е – подозрение на метастаз: лимфатический узел.
А, Г – стандартный анализ (ПЦР + секвенирование): А – в меланоме выявлены две нуклеотидные замены - GAG наряду с нормой GTG, GAA наряду с нормой AAA; Г – в лимфатическом узле мутаций не выявлено.
Б, Д – мутационно-специфическая ПЦР в режиме реального времени: Б – в меланоме выявлена мутация в концентрации около 50%; Д – в лимфатическом узле выявлена мутация в концентрации около 15%.
В, Е – секвенирование продукта мутационно-специфической ПЦР: В – в меланоме выявлен сцепленный характер мутаций (нет сдвоенных пиков на месте нуклеотидных замен), Е – в лимфатическом узле выявлены мутации, идентичные мутациям в меланоме, верифицировано метастатическое поражение.

Список литературы

  • Dominguez PL, Kolodney MS. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 2005 Oct 13;24(45):6830-4. / pmid: 16116485
  • Orou A, Fechner B, Utermann G, Menzel HJ. Allele-specific competitive blocker PCR: a one-step method with applicability to pool screening. Hum Mutat. 1995;6(2):163-9. / pmid: 7581400
  • Seyama T, Ito T, Hayashi T, Mizuno T, Nakamura N, Akiyama M. A novel blocker-PCR method for detection of rare mutant alleles in the presence of an excess amount of normal DNA. Nucleic Acids Res. 1992 May 25;20(10):2493-6. / pmid: 1598207
© 2002-2024 Евроген
Не является публичной офертой
Политика конфиденциальности